ELISA定量方法學開發(fā)實際案例分析
日期：2025-05-16 06:05
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摘要：ELISA定量方法學開發(fā)實際案例分析樣品進行低中高稀釋，用來檢測樣品相對于對照品的平行性，即樣品和對照品在相同的ELISA體系中是否具備相同的**學特性。
如果低中高樣品的信號值在標準曲線合理的定量范圍內
ELISA定量方法學開發(fā)實際案例分析
布局說明
增加了未包被（灰色）的分組，此分組是很有必要的，目的是為了確認待檢測的樣品或者對照品物質對酶標板材的非特異吸附。
樣品進行低中高稀釋，用來檢測樣品相對于對照品的平行性，即樣品和對照品在相同的ELISA體系中是否具備相同的**學特性。
如果低中高樣品的信號值在標準曲線合理的定量范圍內，低中高樣品經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后的三組濃度值接近，說明樣品和對照品平行性較好，平行性較差則該樣品的檢測不能用該對照品作為標準曲線。
ELISA定量方法學開發(fā)實際案例分析一般操作流程
01酶標板的制備：取濃度為100 ug/ml抗體，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至5ug/ml，按加樣布局表加入100ml/孔，分別加入酶標板條中 (Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的空白對照，2-8℃過夜。
02用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時；洗滌液洗板3次，拍干待用；
03抗體對照品的梯度稀釋和樣品的高中低稀釋（Note 3），100ul/孔加入微孔板中標準品稀釋。
04放入奧豪斯微孔板振蕩器內，設置37℃、600rpm振蕩1小時；
05用洗滌液洗板3次，拍干；
06酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯漩渦混合器上混勻，100ul/孔。
07放入微孔板振蕩器內，設置37℃、600rpm振蕩1小時；
08用洗滌液洗板4次，拍干；
09取酶聯(lián)抗體對應的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；
10使用8道排槍以100 ml/孔加入顯色液；
11顯色液室溫避光放置10-30分鐘（Note 5）
12使用8道排槍以100ml/孔加入終止液終止反應；（根據(jù)底物的不同，此步可能不需要）
13用酶標儀測定信號值；（Note 6）
14結果分析（Note 7）
貼心的Note說明-經(jīng)驗總結
Note1：在包被過程中如果需要減少整個ELISA體系試劑對酶標板材的非特異吸附，建議選擇疏水性酶標板材（polysorp）,包被的抗體濃度要足量2-5ug/ul。
Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實驗驗證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。
Note3：在方法學開發(fā)的初期可以拉大一下標準曲線的濃度范圍1000ng/ml-0.1ng/ml。
Note4：酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進行比較選擇，對于單抗成分的酶聯(lián)抗體如果高低兩個稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號傳遞未產(chǎn)生偏差。對于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復雜，可以根據(jù)標準曲線的*高濃度時的回測來判斷酶聯(lián)抗體濃度是否合適，如果對照品較高濃度的兩個點信號值接近，說明多抗酶聯(lián)抗體的濃度過低。
Note 5：對于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號值和顯色時間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認檢測儀器的信號線性范圍，比如一般的酶標儀吸光度值的信號線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時應控制信號值不要超過3，或者將信號值大于3的點不列入標準曲線的擬合。
Note 6：不同底物需要用不同的儀器進行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學發(fā)光讀值。在底物選擇過程中注意實驗室的酶標儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能。
Note 7：標準曲線的劑量曲線擬合可以是線性的，對數(shù)線性或者四參數(shù)擬合，檢驗標準是標準曲線各濃度點的回測偏差小于20%，如果不符合，刪除*高濃度點，直至符合標準。
ELISA定量方法學開發(fā)實際案例分析總結
儀器的檢測信號的線性范圍是有限的，如TMB顯色液的信號的線性范圍在0-3，ELISA方法開發(fā)和優(yōu)化過程更多時候是對于對照品的信號值的控制和調整，以使得信號值在線性范圍內。
使用增強型的TMB顯色，延長顯色時間，增加標準曲線的*高濃度點，增加酶聯(lián)抗體的濃度等增強信號值，反之能夠降低信號值。
在信號值的線性范圍有限的情況下，盡可能的消除非特異吸附的信號值是方法靈敏的關鍵之一，選用疏水性酶標板材，采用分子量更小的封閉劑，采用相對簡單單抗酶聯(lián)抗體或者鏈霉親和素酶聯(lián)抗體等都是有效消除非特異吸附信號的形式。
在ELISA方法學開發(fā)過程中多樣化的試劑耗材的合理選擇和搭配是一個穩(wěn)定，靈敏的ELISA方法的關鍵，而多樣化試劑材料的特性的了解是選擇的關鍵，這個需要在對比實驗中根據(jù)信號的變化系統(tǒng)的去了解和剖析。
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布局說明
增加了未包被（灰色）的分組，此分組是很有必要的，目的是為了確認待檢測的樣品或者對照品物質對酶標板材的非特異吸附。
樣品進行低中高稀釋，用來檢測樣品相對于對照品的平行性，即樣品和對照品在相同的ELISA體系中是否具備相同的**學特性。
如果低中高樣品的信號值在標準曲線合理的定量范圍內，低中高樣品經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后的三組濃度值接近，說明樣品和對照品平行性較好，平行性較差則該樣品的檢測不能用該對照品作為標準曲線。
ELISA定量方法學開發(fā)實際案例分析一般操作流程
01酶標板的制備：取濃度為100 ug/ml抗體，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至5ug/ml，按加樣布局表加入100ml/孔，分別加入酶標板條中 (Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的空白對照，2-8℃過夜。
02用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時；洗滌液洗板3次，拍干待用；
03抗體對照品的梯度稀釋和樣品的高中低稀釋（Note 3），100ul/孔加入微孔板中標準品稀釋。
04放入奧豪斯微孔板振蕩器內，設置37℃、600rpm振蕩1小時；
05用洗滌液洗板3次，拍干；
06酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯漩渦混合器上混勻，100ul/孔。
07放入微孔板振蕩器內，設置37℃、600rpm振蕩1小時；
08用洗滌液洗板4次，拍干；
09取酶聯(lián)抗體對應的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；
10使用8道排槍以100 ml/孔加入顯色液；
11顯色液室溫避光放置10-30分鐘（Note 5）
12使用8道排槍以100ml/孔加入終止液終止反應；（根據(jù)底物的不同，此步可能不需要）
13用酶標儀測定信號值；（Note 6）
14結果分析（Note 7）
貼心的Note說明-經(jīng)驗總結
Note1：在包被過程中如果需要減少整個ELISA體系試劑對酶標板材的非特異吸附，建議選擇疏水性酶標板材（polysorp）,包被的抗體濃度要足量2-5ug/ul。
Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實驗驗證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。
Note3：在方法學開發(fā)的初期可以拉大一下標準曲線的濃度范圍1000ng/ml-0.1ng/ml。
Note4：酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進行比較選擇，對于單抗成分的酶聯(lián)抗體如果高低兩個稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號傳遞未產(chǎn)生偏差。對于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復雜，可以根據(jù)標準曲線的*高濃度時的回測來判斷酶聯(lián)抗體濃度是否合適，如果對照品較高濃度的兩個點信號值接近，說明多抗酶聯(lián)抗體的濃度過低。
Note 5：對于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號值和顯色時間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認檢測儀器的信號線性范圍，比如一般的酶標儀吸光度值的信號線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時應控制信號值不要超過3，或者將信號值大于3的點不列入標準曲線的擬合。
Note 6：不同底物需要用不同的儀器進行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學發(fā)光讀值。在底物選擇過程中注意實驗室的酶標儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能。
Note 7：標準曲線的劑量曲線擬合可以是線性的，對數(shù)線性或者四參數(shù)擬合，檢驗標準是標準曲線各濃度點的回測偏差小于20%，如果不符合，刪除*高濃度點，直至符合標準。
ELISA定量方法學開發(fā)實際案例分析總結
儀器的檢測信號的線性范圍是有限的，如TMB顯色液的信號的線性范圍在0-3，ELISA方法開發(fā)和優(yōu)化過程更多時候是對于對照品的信號值的控制和調整，以使得信號值在線性范圍內。
使用增強型的TMB顯色，延長顯色時間，增加標準曲線的*高濃度點，增加酶聯(lián)抗體的濃度等增強信號值，反之能夠降低信號值。
在信號值的線性范圍有限的情況下，盡可能的消除非特異吸附的信號值是方法靈敏的關鍵之一，選用疏水性酶標板材，采用分子量更小的封閉劑，采用相對簡單單抗酶聯(lián)抗體或者鏈霉親和素酶聯(lián)抗體等都是有效消除非特異吸附信號的形式。
在ELISA方法學開發(fā)過程中多樣化的試劑耗材的合理選擇和搭配是一個穩(wěn)定，靈敏的ELISA方法的關鍵，而多樣化試劑材料的特性的了解是選擇的關鍵，這個需要在對比實驗中根據(jù)信號的變化系統(tǒng)的去了解和剖析。
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